液相色譜儀原理_液相色譜儀能測(cè)什么?HPLC操作步驟[專題]

本文主題詞：液相色譜儀,液相色譜儀原理,液相色譜儀能干什么,高效液相色譜儀操作步驟

一、高效液相色譜儀原理：

高效液相色譜法的原理是在原始的經(jīng)典色譜法基礎(chǔ)上面引用氣象色譜的理論，把原來(lái)的流動(dòng)性改變?yōu)閴毫蛇_(dá)到4.9′107Pa。色譜柱則是用特殊的方式用小顆粒裝填而成。造成的結(jié)果就是色譜柱的柱效遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始的經(jīng)典液相色譜。并且它柱子使用后還能具有高度靈敏度檢測(cè)器。能夠?qū)α鞒鰜?lái)的分析物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

通俗來(lái)講就是：

多年前大學(xué)老師講的，至今認(rèn)為是最形象的對(duì)“色譜”的描述—講一群女孩子去逛街，街上店鋪林立，但是每個(gè)女孩子都有自己不同的喜好于是有的進(jìn)了這家，有的進(jìn)了那家，最后大家越走越分散，所以有的先走出這條街，有的后走出來(lái)—女孩子指化合物，這條街是色譜柱。店鋪是固定相，推著化合物走得是流動(dòng)相，提供動(dòng)力的是泵，最后站在街尾數(shù)人數(shù)認(rèn)人的是檢測(cè)器。認(rèn)人帶著照片啥的是標(biāo)準(zhǔn)品，認(rèn)出來(lái)走到倒數(shù)第二個(gè)的女孩就是你朝思暮想的那位。就可以定義或定量分析了。這就是高效液相色譜儀的原理

二、高效液相色譜儀能測(cè)什么？

高效液相色譜儀是利用混合物各組分在固定相和流動(dòng)相中溶解、分配或吸附等化學(xué)作用性能的差異，使各組分在作相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。高效液相色譜儀在食品分析、環(huán)境分析、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和無(wú)機(jī)分析等領(lǐng)域得到廣泛使用。一般來(lái)說(shuō)，80%～85% 的有機(jī)物原則上可采用高效液相色譜儀分析。

一、在食品分析中的應(yīng)用：

1、食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：

蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸等）、有機(jī)胺和礦物質(zhì)等分析。

2、食品添加劑分析：

甜味劑、防腐劑、著色劑（檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃和亮藍(lán)等）和抗氧化劑等分析。

3、食品污染物分析：霉菌毒素（、黃桿菌毒素和大腸桿菌毒素等）、微量元素和多環(huán)芳烴等分析。

二、在環(huán)境分析中的應(yīng)用：

多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）和農(nóng)藥殘留（氨基甲酸脂類，反相色譜）等分析。

三、在生命科學(xué)中的應(yīng)用：

1、低分子量物質(zhì)：氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇、卟啉、糖類和維生素等分析。

2、高分子量物質(zhì)：多肽、核糖核酸、酶（胰島素、激素、細(xì)胞色素和干擾素等）和蛋白質(zhì)等分析。

四、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用：1、合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物和黃胺類藥等分析。2、天然藥物生物堿：吲哚堿、顛茄堿和強(qiáng)心甙等分析。五、在無(wú)機(jī)分析中的應(yīng)用：陽(yáng)、陰離子等分析。這就是高效液相色譜儀能測(cè)什么？

三、高效液相色譜儀操作步驟：

1、開(kāi)機(jī)設(shè)定參數(shù)（檢測(cè)波長(zhǎng)、流速），更換所需流動(dòng)相，檢查色譜柱是否正確。

2、排液置換管路中流動(dòng)相，沖洗進(jìn)樣閥，洗好進(jìn)樣針。

3、沖洗色譜柱進(jìn)行平衡，其間可提前進(jìn)行樣品的處理，樣品信息的注冊(cè)。

4、平衡好以后進(jìn)空白試驗(yàn)，排除系統(tǒng)污染。

5、柱子穩(wěn)定好以后進(jìn)樣，等待運(yùn)行結(jié)束（其間清洗進(jìn)樣針），積分計(jì)算，出具報(bào)告。

詳細(xì)操作步驟如下：

1、 開(kāi)機(jī)操作：

（1）、打開(kāi)電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開(kāi)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)Bootp Server（一般啟動(dòng)時(shí)已打開(kāi)）；

（2）、自上而下打開(kāi)個(gè)組件電源，Bootp Server里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開(kāi)工作站（先打開(kāi)On line）；

（3）、打開(kāi)沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開(kāi)關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；

（4）、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；

（5）、使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。

2、 先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min 左右開(kāi)啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命；

3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

4、 使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；

5、 溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；

6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈；

7、 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開(kāi)關(guān)；

8、 使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，不要擅自拆卸儀器。

流動(dòng)相：

1、 流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭?、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；

2、 水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；

3、 使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；

A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。

樣品：

1、 采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；

2、 用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤?，盡量用流動(dòng)相制備樣品液；

手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；

色譜柱：

1、 使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書(shū)，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等；

2、 使用符合要求的流動(dòng)相；

3、 使用保護(hù)柱；

4、 如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。

5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；

6、 不要高壓沖洗柱子；

7、 不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；

4、高效液相色譜儀注意事項(xiàng)：

1）流動(dòng)相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動(dòng)相要小心振動(dòng)盡量不引起氣泡。

2）柱子是非常脆弱的，*次做的方法，先不要讓液體過(guò)柱子。

3）所有過(guò)柱子的液體均需嚴(yán)格地過(guò)濾。

4）壓力不能太大，不要超過(guò)2000psi

1.使用“保護(hù)柱”，能夠延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。簡(jiǎn)單的說(shuō)，“保護(hù)柱”即是很短的色譜柱，填裝和所使用液相色譜柱相同的填料。正確使用裝在液相色譜柱前面的“保護(hù)柱”，可以阻攔一些容易損壞液相色譜柱的物質(zhì)。而達(dá)到延長(zhǎng)柱子壽命的效果。如果使用“保護(hù)柱”不當(dāng)會(huì)造成反效果。因?yàn)槎荚诒Ｗo(hù)柱使用過(guò)程中。如污染達(dá)到一定程度而沒(méi)有及時(shí)更換，累積的雜物很可能會(huì)沖入色譜柱中，反而會(huì)造成色譜柱損壞。因此。使用“保護(hù)柱”時(shí)，zui重要的是要知道什么時(shí)候該保護(hù)柱。該換的時(shí)候就必須要立即更換。

2.選擇高品質(zhì)的柱子，并注意使用方法；可以延長(zhǎng)柱子的使用壽命。一般認(rèn)為同一廠牌、同一型號(hào)的柱子之間的品質(zhì)都相同，對(duì)品質(zhì)管理很嚴(yán)格的廠家而言，這種說(shuō)法是成立的。但如果廠家質(zhì)管理不夠嚴(yán)格，即使是同一批號(hào)的新柱子之間的品質(zhì)也有差異。所以，選用柱子時(shí)必須選擇管理嚴(yán)格的高品質(zhì)柱子，我們知道，任何柱子使用過(guò)后都會(huì)產(chǎn)生變化。尤其如在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下使用，柱子更易產(chǎn)生變化。因此，盡量選用pH適用范圍大的柱子。在開(kāi)發(fā)信分析方法時(shí)，許多專家建議不要使用舊柱子。因柱子一經(jīng)使用。柱性會(huì)改變；如此一來(lái)，使用舊柱子開(kāi)發(fā)出來(lái)的新分析方法，很可能在使用同廠牌的新柱子分析時(shí)。發(fā)生無(wú)法達(dá)到預(yù)定效果的情況。總的說(shuō)。開(kāi)發(fā)新分析方法時(shí)使用品質(zhì)好的新主子；并且一直柱子應(yīng)該使用在一種分析方法上；則柱子壽命可以延長(zhǎng)。

3.定期沖洗柱子可以延長(zhǎng)柱子使用壽命。我們知道柱子使用一段時(shí)間后總會(huì)有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi)。這些雜質(zhì)不會(huì)隨著流動(dòng)相出來(lái)，自然會(huì)逐漸影響柱子的品質(zhì)。這些雜質(zhì)在后來(lái)的分析譜圖上出現(xiàn)。而造成出現(xiàn)怪峰、基線不平等現(xiàn)象。簡(jiǎn)單的解決方法是用較強(qiáng)的流動(dòng)相沖洗。是在每次分析某一產(chǎn)品完成后沖洗。如果分析時(shí)使用緩沖劑時(shí)，用水來(lái)取代緩沖劑。先使用有機(jī)和水的混合溶液為流動(dòng)沖洗緩沖劑。接著再用99%有機(jī)溶劑沖洗。如果不先用有機(jī)和水的混合溶液沖洗，而直接用99%有機(jī)溶劑沖洗的話，緩沖劑很可能會(huì)沉淀出來(lái)，而損壞柱子的品質(zhì)。使用10-20倍柱體積的量來(lái)沖洗基本就足夠了。專家建議將99%有機(jī)溶劑沖洗的條件加在分析實(shí)驗(yàn)程序完畢的zui后，如此一來(lái)每天在開(kāi)機(jī)前都會(huì)用99%有機(jī)溶劑沖洗。一般硅膠柱可以反沖洗處理，即是在將沖洗前將柱子倒反接后再?zèng)_洗。打算使用反沖洗處理前，先參考柱子的保養(yǎng)說(shuō)明書(shū)。所以要真正保護(hù)柱子，使用柱子的壽命延長(zhǎng)，是使用“保護(hù)柱”和定期沖洗柱子。

五、高效液相色譜儀于超高效液相色譜儀區(qū)別：

高效液相是兩種或四種流動(dòng)相在泵前進(jìn)行混合，通過(guò)比例閥，比例閥是通過(guò)時(shí)間來(lái)控制比例的，容易產(chǎn)生氣泡，所以一般都加脫氣包或脫氣機(jī)，例如waters的ACQUITY系列產(chǎn)品，安捷倫的1200,1260，而超高液相兩種或四種流動(dòng)相直接通過(guò)高壓泵控制比例在泵后混合，可以不需要脫氣包或脫氣機(jī)，因?yàn)閴毫芨?，混合時(shí)也不產(chǎn)生氣泡，同樣的超高液相使用的色譜柱粒徑更小，高效液相色譜一般使用色譜柱填料粒徑在5μm，3.2μm，很少使用1.7μm的色譜柱，而超高液相可以使用1.7μm內(nèi)徑的填料色譜柱，色譜柱長(zhǎng)也可以增加到250mm，減少分離時(shí)間，使分析時(shí)間大大的降低。

六、高效液相色譜儀組成和分類：

高效液相色譜儀的組成及分類
1. 高壓輸液系統(tǒng)
貯液裝置、高壓、過(guò)濾器、脫氣裝置等
1.1. 貯液器：貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對(duì)溶劑呈惰性。貯液器應(yīng)配有溶劑過(guò)濾器，以防止活動(dòng)相中的顆粒進(jìn)進(jìn)泵內(nèi)。溶劑過(guò)濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，空隙大小一般為2mm。
1.2. 脫氣裝置：脫氣的目的是為了防止活動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí)，開(kāi)釋出氣泡進(jìn)進(jìn)檢測(cè)器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測(cè)。
1.3. 高壓 高壓是高效液相色譜儀的重要部件，是驅(qū)動(dòng)溶劑和樣品通過(guò)色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)的高壓源，其性能好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性。
對(duì)高壓泵的基本要求是：
①流量穩(wěn)定；②輸出壓力高，zui高輸出壓力為50Mpa；③流量范圍寬，可在0.01～10ml／min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動(dòng)小。
1.2. 梯度洗脫裝置 梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時(shí)間程序連續(xù)或階段地改變配比濃度，以達(dá)到改變活動(dòng)相極性、離子強(qiáng)度或pH值，從而進(jìn)步洗脫能力，改善分離的一種有效方法。當(dāng)一個(gè)樣品混合物的容量因子是范圍很寬，用等度洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，且后出的峰形扁平不便檢測(cè)時(shí)，用梯度洗脫可以改善峰形、并縮短分離時(shí)間。HPLC的梯度洗脫與GC的程序升溫相似，可以縮短分析時(shí)間，進(jìn)步分離效果。使所有的峰都處于分離狀態(tài)，而且峰形尖而窄。
2 進(jìn)樣器
進(jìn)樣器一般要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)小，并便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
高壓進(jìn)樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類很多，有六通閥、四通閥，雙路閥等。以六通進(jìn)樣閥zui為常用。
3.分離系統(tǒng)
色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和活動(dòng)相。色譜柱是其核心部分，柱應(yīng)具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內(nèi)死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長(zhǎng)的要求。通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制成。
色譜柱按內(nèi)徑不同可分為常規(guī)柱、快速柱和微量柱三類。
常規(guī)分析柱柱長(zhǎng)一般為10~25cm，內(nèi)徑4 ~ 5mm，固定相顆粒直徑為 5 ~ 10 mm。為了保護(hù)分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，約數(shù)厘米長(zhǎng)，稱為保護(hù)柱。
（微量分析柱內(nèi)徑小于l mm，凝膠色譜往內(nèi)徑3～12 mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25 mm以上。）
4 檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，常用檢測(cè)器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。
4. 1. 紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器（ultraviolet－visible detector，UVD）
紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器（UVD）是HPLC中應(yīng)用zui廣泛的檢測(cè)器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測(cè)器。其特點(diǎn)是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對(duì)強(qiáng)吸收物質(zhì)檢測(cè)限可達(dá)1ng，檢測(cè)后不破壞樣品，可用于制備，并能與任何檢測(cè)器串聯(lián)使用。紫外可見(jiàn)檢測(cè)器的工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計(jì)相似，實(shí)際上就是裝有活動(dòng)地的紫外可見(jiàn)光度計(jì)。
（1）紫外吸收檢測(cè)器：
紫外吸收檢測(cè)器常用氘燈作光源，氘燈則發(fā)射出紫外-可見(jiàn)區(qū)范圍的連續(xù)波長(zhǎng)，并安裝一個(gè)光柵型單色器，其波長(zhǎng)選擇范圍寬（190nm～800nm）。它有兩個(gè)流通池，一個(gè)作參比，一個(gè)作丈量用，光源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過(guò)純的均勻溶劑，則它們?cè)谧贤獠ㄩL(zhǎng)下幾乎無(wú)吸收，光電管上接受到的輻射強(qiáng)度相等，無(wú)信號(hào)輸出。當(dāng)組分進(jìn)進(jìn)丈量池時(shí)，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強(qiáng)度不等，這時(shí)有信號(hào)輸出，輸出信號(hào)大小與組分濃度有關(guān)。
局限：活動(dòng)相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做 活動(dòng)相，每種溶劑都有截止波長(zhǎng)，當(dāng)小于該截止波長(zhǎng)的紫外光通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)不能小于溶劑的截止波長(zhǎng)
（2）光電二極管陣列檢測(cè)器（photodiode array detector， PDAD）：
也稱快速掃描紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器，是一種新型的光吸收式檢測(cè)器。它采用光電二極管陣列作為檢測(cè)元件，構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再進(jìn)射到陣列式接收器上的全部波長(zhǎng)的光信號(hào)，然后對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到吸收值(A)是保存時(shí)間(tR)和波長(zhǎng)(l)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時(shí)觀察與每一組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速?zèng)Q定具有選擇性和靈敏度的波長(zhǎng)。

七、高效液相色譜儀價(jià)格：

液相色譜儀價(jià)格：

1290 Infinity II 液相色譜儀

參考成交價(jià)格： 11.2萬(wàn)元[美元]

安捷倫, 效率優(yōu)先，分析效率、儀器效率、實(shí)驗(yàn)室運(yùn)營(yíng)效率

ACQUITY Arc UHPLC超高效液相色譜儀

參考成交價(jià)格： 8.98萬(wàn)元[美元]

沃特世, 四元溶劑管理UHPLC，HPLC和UHPLC方法切換簡(jiǎn)單，幫助用戶從HPLC過(guò)渡到UPLC

Vanquish flex UHPLC超高效液相色譜儀

參考成交價(jià)格： 8萬(wàn)元[美元]

賽默飛, 四元泵，耐壓15000psi流速達(dá)8mL/min，控溫準(zhǔn)確，增加熒光檢測(cè)器

Nexera UC 在線SFE/SFC色譜系統(tǒng)

參考成交價(jià)格： 11.52萬(wàn)元[美元]

島津, 是LC，GC & SFC 等分析模式統(tǒng)一的新技術(shù)，同時(shí)也是樣品制備和分離統(tǒng)一的新技術(shù)

iChrom5100系列高效液相色譜儀

參考成交價(jià)格： 15~25萬(wàn)元[人民幣]

依利特, 高集成度的ARM微控制器及SPI、I2C總線技術(shù)，靈活實(shí)現(xiàn)LAN及RS485通訊方式

LC-100plus 二元高壓高效液相色譜儀

參考成交價(jià)格： 7.65~10.85萬(wàn)元[人民幣]

8、高效液相色譜儀圖片如上所示。