(1)．過(guò)濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。

　　(2)．對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。

　　(3)．打開(kāi)HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。

　　(4)．進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。

　　(5)．有一段時(shí)間沒(méi)用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過(guò)10 ml/min。

　　(6)．調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過(guò)2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。

　　(7)．設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。

　　(8)．進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過(guò)濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。

　　(9)．關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。

　　(10)．填寫(xiě)登記本，由負(fù)責(zé)人簽字。

　　1、開(kāi)機(jī)設(shè)定參數(shù)（檢測(cè)波長(zhǎng)、流速），更換所需流動(dòng)相，檢查色譜柱是否正確。

　　2、排液置換管路中流動(dòng)相，沖洗進(jìn)樣閥，洗好進(jìn)樣針。

　　3、沖洗色譜柱進(jìn)行平衡，其間可提前進(jìn)行樣品的處理，樣品信息的注冊(cè)。

　　4、平衡好以后進(jìn)空白試驗(yàn)，排除系統(tǒng)污染。

　　5、柱子穩(wěn)定好以后進(jìn)樣，等待運(yùn)行結(jié)束（其間清洗進(jìn)樣針），積分計(jì)算，出具報(bào)告。

　　詳細(xì)操作步驟如下：

　　1、開(kāi)機(jī)操作：

　　（1）、打開(kāi)電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開(kāi)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)Bootp Server（一般啟動(dòng)時(shí)已打開(kāi)）；

　?。?）、自上而下打開(kāi)個(gè)組件電源，Bootp Server里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開(kāi)工作站（先打開(kāi)On line）；

　?。?）、打開(kāi)沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開(kāi)關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；

　?。?）、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；

　?。?）、使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。

　　2、先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min左右開(kāi)啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命；

　　3、建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

　　4、使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；

　　5、溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；

　　6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈；

　　7、關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開(kāi)關(guān)；

　　8、使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，不要擅自拆卸儀器。

　　流動(dòng)相：

　　1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭?、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；

　　2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；

　　3、使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；

　　A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。

　　樣品：

　　1、采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；

　　2、用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相小）的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動(dòng)相制備樣品液；

　　手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；

　　色譜柱：

　　1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書(shū)，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類(lèi)型等；

　　2、使用符合要求的流動(dòng)相；

　　3、使用保護(hù)柱；

　　4、如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。

　　5、色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；

　　6、不要高壓沖洗柱子；

　　7、不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；

　　1儀器組成及開(kāi)機(jī)

　　1.1儀器組成本儀器由Waters 2695分離單元、2996型二極管陣列檢測(cè)器、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、色譜管理工作站和打印機(jī)組成。

　　2695分離單元包括四元梯度洗脫的溶劑輸送系統(tǒng)，四通道在線真空脫氣機(jī)（或氦氣脫氣機(jī)），可容納120個(gè)樣品瓶的自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，柱溫箱，內(nèi)置的柱塞桿密封墊清洗系統(tǒng)，溶劑瓶托盤(pán)，液晶顯示器，鍵盤(pán)用戶(hù)界面及軟盤(pán)驅(qū)動(dòng)器。

　　1.2開(kāi)機(jī)依次接通2695分離單元、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)和打印機(jī)的電源。接通2695分離單元后，約20s儀器開(kāi)始自檢，約1min后，顯示主屏幕，此時(shí)繼續(xù)各部件的初始化，待主屏幕上方標(biāo)題區(qū)出現(xiàn)“Idle”時(shí)，儀器進(jìn)入待命狀態(tài)。

　　2溶劑管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備

　　2.1流動(dòng)相脫氣確認(rèn)所有溶劑管路都充滿溶劑，按【Menu/Status】，進(jìn)入“Status（1）”屏幕，光標(biāo)選“Degasser”，按【Enter】，顯示選項(xiàng)屏幕，光標(biāo)下移選“Continuous”，按【Enter】。

　　2.2啟動(dòng)溶劑管理系統(tǒng)

　　2.2.1干啟動(dòng)當(dāng)溶劑的管路是干的或是需要更換溶劑時(shí)，在“Status（1）”屏幕下，按【Direct Function】，光標(biāo)選“Dry Prime”，按【Enter】，顯示“Dry Prime”屏幕，按欲啟動(dòng)的溶劑管路的屏幕鍵，如【OpenA】，光標(biāo)選“Duration”，按數(shù)字鍵輸入5min，按【Continue】，待限定時(shí)間結(jié)束后，重復(fù)操作，使實(shí)驗(yàn)所需的各溶劑管路均啟動(dòng)、排氣并充滿流動(dòng)相。

　　2.2.2濕啟動(dòng)在“Status（1）”屏幕下，光標(biāo)選“Compomtion”中欲使用的流動(dòng)相，輸入10 0％，按【Direct Function】，光標(biāo)選“Wet Prime”，按【Enter】，顯示“Wet Prime”屏幕，輸入7.5Ml/min和6min，按【OK】，待限定時(shí)間結(jié)束后，對(duì)每種流動(dòng)相重復(fù)操作。

　　2.2.3平衡真空脫氣機(jī)在“Status（1）”屏幕下，光標(biāo)選“Composition”，輸入流動(dòng)相的組成，按【Enter】再用光標(biāo)選“Degasser”中的“Normal”，按【Enter】，按【Direct Function】，光標(biāo)選“Wet Prime”，輸入0.000mL/min和10min.，按【OK】。待限定時(shí)間結(jié)束后，按【Abort Prime】。

　　3樣品管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備

　　3.1沖洗自動(dòng)進(jìn)樣器在“Status（1）”屏幕下，光標(biāo)選“Composition”，輸入流動(dòng)相的組成。按【Direct Function】，光標(biāo)選“PurgeInjector”，按【Enter】，顯示“Purge Injector”屏幕，輸入“Sample Loop Volumes 6.0”，光標(biāo)下移“Compression Check”，按任意數(shù)字鍵，按【OK】。

　　3.2沖洗進(jìn)樣針在主屏幕下，按【Diag】，顯示“Diagnositcs”屏幕，按【Prime Ndl Wash】，顯示“Prime Needle Wash”屏幕，按【Start】，30s內(nèi)應(yīng)見(jiàn)溶劑從廢液排放口流出。按【Close】、【Exit】。

　　3.3沖洗柱塞桿密封墊在主屏幕下，按【Diag】，顯示“Diagnosities”屏幕，按Prime Seal Wash，顯示“Prime Seal Wash”屏幕，按【Start】，待排放口有水流出，按【Halt】、【Close】、【Exit】。

　　3.4裝入樣品與轉(zhuǎn)盤(pán)將樣品瓶插到樣品盤(pán)合適的位置，打開(kāi)樣品倉(cāng)門(mén)，顯示“Door is Open”屏幕，裝入樣品盤(pán)，按【Next】，直至所有樣品盤(pán)裝畢，關(guān)倉(cāng)門(mén)。

　　4編輯分析方法及執(zhí)行樣品分析表

　　在主屏幕下，按【Develop Methods】，顯示“Methods”屏幕。

　　4.1編輯分析方法

　　4.1.1建立新的分離方法在“Method”屏幕下，按【New】、【Separation Methods】，輸入方法名，按【Enter】，顯示分離方法屏幕，該屏幕共有6頁(yè)，通過(guò)按【Next】或【Prev】切換。如需設(shè)定梯度，在第（1）頁(yè)按【Gradient】，輸入后按【Exit】；如需設(shè)定色譜柱的溫度，在第（4）頁(yè)輸入后按【Exit】；在第（6）頁(yè)設(shè)定檢測(cè)器的種類(lèi)，光標(biāo)選“Absorbance Detector”，按【Enter】，光標(biāo)選“48 6﹨2487”，按Abs（1）圖標(biāo)，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)，按【OK】、【Exit】、【Save】。

　　4.1.2編輯已建立的分離方法在“Methods”屏幕下，光標(biāo)選欲編輯﹨修改的分離方法的圖標(biāo)，按【Edit】，編輯改各種分析參數(shù)，按【Exit】、【Save】。

　　4.2編輯執(zhí)行樣品分析表

　　4.2.1建立新的樣品組在“Methods”屏幕下，按【New】、【Sample Set】，輸入樣品組名，按【Enter】，顯示方法組屏幕，在樣品組表中輸入待分析樣品的信息。在“Vial”中輸入樣品放置的位置；在“Function”中光標(biāo)選擇“Sandard”或“Sample”；在“Method”中選擇已建立的方法；在“inj”中輸入進(jìn)樣的次數(shù)；在“μL”中輸入進(jìn)樣的體積；在“min”中輸入運(yùn)行時(shí)間。按【Exit】、【Save】。

　　4.2.2編輯已建立的樣品組在“Methods”屏幕下，光標(biāo)選欲編輯﹨修改的方法組的圖標(biāo)，按【Edit】，編輯﹨修改待分析樣品的信息，按【Exit】、【Save】。

　　5運(yùn)行樣品

　　5.1在“Status（1）”屏幕下，光標(biāo)選“Method”，按【Enter】，選已建立的分離方法；光標(biāo)選“Flow”，輸入流速，光標(biāo)選“Composition”，輸入流動(dòng)相的組成。

　　5.2在主屏幕下，按【Run Samples】，光標(biāo)選已建立的樣品組，按【Run】、【Satrt】。

　　6報(bào)告打印

　　在主屏幕下，按【Config】，顯示“Configuration”屏幕，按【Reports】，在“Report Options”對(duì)話框中選擇欲輸出到打印機(jī)或軟盤(pán)的信息，按【OK】、【Exit】。

　　7關(guān)機(jī)

　　7.1使用完畢，按規(guī)定用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜柱、系統(tǒng)管路、自動(dòng)進(jìn)樣器、進(jìn)樣針和柱塞桿密封墊，確保2695分離單元已*沖洗干凈后，關(guān)閉電源開(kāi)關(guān)。

　　7.2數(shù)據(jù)采集完畢后，關(guān)閉檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)。

　　7.3處理數(shù)據(jù)并打印報(bào)告后，關(guān)閉計(jì)算機(jī)和打印機(jī)電源開(kāi)關(guān)，并做使用登記。

　　附注：

　?。?）2695分離單元除用上述的系統(tǒng)控制模式外，還可設(shè)置非交互模式和色譜工作

　　站控制模式，詳見(jiàn)儀器使用說(shuō)明書(shū)。

　　（2）色譜管理工作站

　?、倥渲冒惭b了數(shù)據(jù)處理軟件的計(jì)算機(jī)。

　?、跀?shù)據(jù)處理如果使用Waters的Millennium色譜管理工作站控制2695分離單元分析測(cè)定樣品，當(dāng)工作站采集數(shù)據(jù)時(shí)，2695分離單元屏幕上方的標(biāo)題區(qū)出現(xiàn)“Remote”。色譜管理工作站的基本操作步驟為：設(shè)置一個(gè)含有2695分離單元的色譜系統(tǒng)，建立一個(gè)含有2695分離單元的儀器方法，用已獲得的儀器方法建立一個(gè)方法組，用已建立的方法組運(yùn)行樣品，處理并打印出色譜運(yùn)行所得到的數(shù)據(jù)

高效液相色譜法(HPLC)是目前應(yīng)用廣泛的分離、分析、純化有機(jī)化合物(包括能通過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)化合物的無(wú)機(jī)物)的有效方法之一。 在已知的有機(jī)化合物中，約有80%能用高效液相色譜法分離、分析，而且由于此法條件溫和，不破壞樣品，因此特別適合高沸點(diǎn)、難氣化揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物和生命物質(zhì)。

高效液相色譜儀是在經(jīng)典液相柱色譜儀的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜儀的理論，采用了高壓、高效固定相、梯度洗脫技術(shù)和高靈敏度檢測(cè)器，具有高壓、高速、高效、高靈敏度、高選擇性和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

高效液相色譜儀使用注意事項(xiàng):

1、高效液相色譜的流動(dòng)相應(yīng)采用色譜純?nèi)軇?，以滿足儀器要求、避免損壞色譜柱;

2、嚴(yán)禁使用有污染的水等沖洗色譜柱，避免將互不相溶的溶劑一同進(jìn)入泵內(nèi);

3、流動(dòng)相需經(jīng)過(guò)濾、除氣后方可使用;

4、待分析的樣品必須*溶解澄清、過(guò)濾，以避免堵塞、損壞色譜柱;

5、分析完成后，須注意及時(shí)清洗色譜柱和檢測(cè)器的比色池。

五、高效液相色譜柱標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)

色譜柱的使用和保養(yǎng)：液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路，建立高效液相色譜柱日常維護(hù)與保養(yǎng)規(guī)程，保證能正常使用。

（1）液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。

柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70kg/cm²時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。空柱各組件均為不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以避免腐蝕。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。

密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

（2）柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。

正相柱：

多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10μm的范圍內(nèi)。另一類(lèi)正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH₂等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：

主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3-10μm之間。

（1）拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類(lèi)型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。

（2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。

（3）按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如，條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57 mm、內(nèi)徑為0、1～0.3 mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止。

色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是更佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

（1）使用流動(dòng)相溶解樣品；

（2）使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)；

（3）使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)；

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此，要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

（1）流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

（2）流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

（3）流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)，降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

（4）流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)，如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

（5）流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。

（6）在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求更佳柱效，使用更佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mL/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mL/min為佳。當(dāng)選用更佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如，使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

（1）由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。

（2）對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

（3）含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入xx，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

（4）流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

（5）使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)完后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

如，色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存，必須存于合適的溶劑下，對(duì)于反相柱可以?xún)?chǔ)存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以?xún)?chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以?xún)?chǔ)存于水(含防腐劑或硫柳汞)中，并將堵頭堵上，儲(chǔ)存溫度應(yīng)該是室溫。

因?yàn)椋V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)是柱效的下降。

依次采用20～30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90(V/V)，乙腈，異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。

依次以20～30倍的色譜柱體積正己烷、異丙醇(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過(guò)高)、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意以上溶劑必須嚴(yán)格脫水。

長(zhǎng)時(shí)間在緩沖溶液中使用和進(jìn)樣，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽(yáng)離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。

再生過(guò)程必須隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，柱壓過(guò)高易導(dǎo)致硅膠變形與開(kāi)裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時(shí)要保證再生時(shí)間足夠。再生時(shí)選擇不具備在線脫氣的獨(dú)立泵送系統(tǒng)色譜儀器進(jìn)行，以防正相溶劑損壞脫氣機(jī)密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。

解決方案：首先查看是否HPLC系統(tǒng)原因，排除系統(tǒng)原因后，原因基本是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雜質(zhì)在柱中的累積。盡量完善操作條件，做完樣品后要及時(shí)沖洗干凈，如緩沖鹽的流動(dòng)相一定要用高比例的水溶液(如，90%)沖洗*后再用有機(jī)相保存。

解決方法：如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20分鐘左右，再用純水超聲20分鐘左右，重新裝入色譜柱。

解決方法：

如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

解決方法：

如確定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

1、無(wú)論何時(shí)，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進(jìn)樣檢測(cè)和柱沖洗過(guò)程中不能讓流動(dòng)相長(zhǎng)時(shí)間(30min以上)走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o(wú)法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開(kāi)裂。

2、使用與保存時(shí)，嚴(yán)禁用力甩，杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導(dǎo)致柱床機(jī)械性損壞，則再無(wú)再生可能。

3、當(dāng)柱子和液相色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；

4、避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；

5、進(jìn)樣樣品要全溶解；

6、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2～7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍；

7、每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；

8、每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；

9、若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉。

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